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棉纤维发育基因克隆专题
1 利用CTAB/酸酚法提取棉花组织总RNA 的研究  
    结合棉花总DNA的CTAB提取法和总RNA的LiCl沉淀法,发展出一套高效的棉花总RNA提取方法,即CTAB/酸酚法。该方法操作步骤快速简便,整个提取过程可在一天时间内完成,减少了总RNA降解的几率和损失量。提取的RNA纯度高,可有效地去除棉花组织特别是胚珠、纤维细胞中丰富的蛋白、脂肪和多糖物质,可防止RNA的褐化,RNA具有正常的紫外吸收谱线。同时RNA的完整性好,rRNA条带清楚,完全可满足RT-PCR、Northern blotting等分子生物学实验的要求。

 

2 棉纤维发育相关基因全长cDNA序列的克隆及其特征分析

     在几个棉纤维cDNA部分序列的基础上,采用优化的PCR-96孔板法筛选体系先后从一个陆地棉纤维cDNA文库中分离出4个新的纤维发育相关基因的全长cDNA序列,包括碱性亮氨酸蛋白基因GhbZIP、羧基末端蛋白酶基因GhCTP、半胱氨酸蛋白酶基因GhCP、β-甘露糖苷蛋白酶基因GhManA2以及另外一个不能肯定是否为完整序列的GhManA1,并对其序列结构特征和基因表达特征进行了研究。

 

 

3 棉纤维伸长发育相关基因克隆的初步研究

    采用mRNA差异显示技术对陆地棉遗传标准系TM-1以及两个陆地棉纤维伸长发育突变体Ligonlintless-1Ligonlintless-2在纤维伸长发育阶段的基因表达进行比较分析。结果表明标准系与两个突变体之间在开花后5d时纤维细胞内的基因表达基本上没有差异,但开花后10d的纤维细胞中则出现多种差异表达基因类型。最后共克隆到10个差异表达基因片段,但绝大多数为新的棉花EST。其中一个只在TM-1纤维细胞中表达的基因片段GhE3,与GenBank中一系列主要来源于多种植物生殖器官的EST高度同源。对其中一个长度为787bp的番茄同源cDNA进行分析,发现其序列中含有一个完整的ORF,该ORF编码一个有146AA的泛素蛋白核糖体蛋白,其C末端的伸展蛋白部分是核糖体40S亚基的结构成分。这表明纤维细胞中该泛素蛋白核糖体蛋白的同源蛋白可能与纤维细胞的伸长发育有关。 

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